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石蠟切片免疫組化染色實驗操作流程
發布時間:2019/11/19 9:01:45 閱讀次數:13

     1.石蠟切片脫蠟至水:(石蠟切片染色前應置 60℃ 1 小時) 。

 
    ① 二甲苯 、II,各 10 分鐘。
    ② 梯度酒精:100%,2 分鐘 95%,2 分鐘 80%,2 分鐘 70% 2 分鐘。
    ③ 蒸餾水洗:5 分鐘,2 次(置于搖床)。
 
    2.過氧化氫封閉內源性過氧化物酶:3%H2 O2 ,室溫 10 分鐘(避光) 。
 
    3.蒸餾水洗:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
 
    4.抗原修復:根據待檢測的抗原,選擇適當的方法。
 
    附:抗原修復液(10mMpH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液)的配制:① 儲備液的配制:A 液:枸櫞酸三鈉- 2H2O 29.41g + 蒸餾水 1000ml;B 液:枸櫞酸 21g + 蒸餾水 1000ml;② 工作液的配制:A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸餾水 900ml
 
    抗原修復的方法:
     ① 高壓鍋處理技術:枸櫞酸鈉緩沖液(10mM,PH6.0),淹沒切片,蓋上鍋蓋,高壓鍋內煮沸,上汽 3 分鐘后緩慢冷卻(可用自來水在高 壓鍋外沖,以助冷卻) 。
 
    ② 微波處理技術:用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內,枸櫞酸 鈉緩沖液淹沒切片,選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補充已預熱的 枸櫞酸鈉緩沖液; 再選擇中高或高檔,5分鐘(.*佳溫度為 92 95℃)
 
    ③ 酶消化處理。
 
    抗原修復的注意事項:① 組織不能干。 ② 選擇抗原修復方法要因抗體而異。 ③ 該方法主要用于 10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。④ 抗原修復后至 DAB 顯色的過程中,均需用 PBS 緩沖液。
 
    5.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
 
    6.正常血清封閉:從染片缸中取出切片,擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 (保持組織呈濕潤狀態,)滴加正常山羊或兔血清 (與第二抗 體 同源動物血清)處理,37℃,15 分鐘。
 
    附:正常血清配制 ( 或按試劑盒規定的濃度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計算。
 
    7.滴加抗體:用濾紙吸去血清,不洗,直接滴加抗體,37℃ 2 小時(也可置于 4℃冰箱過夜) 。
 
    8.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
 
    9.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分鐘。
 
    10.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
 
    11.滴加三抗 (SAB 復合物) ,37℃,40 分鐘。
 
    12.PBS:5 分鐘,2 次(置于搖床) 。
 
    13.DAB 顯色,鏡下觀察,適時終止(自來水沖終止) 。
 
    附:DAB 的配制① 儲備液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分裝成 1ml,100μl,50μl ,20μ l 等,-20℃,凍存。② 工作液:DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
 
    14.自來水(細水)充分沖洗。
 
    15.蘇木素復染,室溫,30 秒,自來水沖洗。
 
    16.自來水沖洗返藍,15 分鐘。
 
    17.梯度酒精脫水:80%,2 分鐘 95%,2 分鐘 100%,2 次,5 分鐘。
 
    18.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分鐘。
 
    19.封片:加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。
 
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